【流式應用知多少】抗體親和力檢測方案

本期簡(jiǎn)介：

  單克隆抗體（mAb）具有靶向性強、特異性高和毒副作用低等特點(diǎn)，目前已經(jīng)成功用于治療免疫、癌癥等多種疾病領(lǐng)域。本期小貝想要介紹給大家如何快速、、準確的篩選到高親和性的單克隆，以及如何提高抗體親和力助于改善抗體的特異性和效力，減少用藥劑量降低毒副作用等都是抗體藥物研發(fā)的關(guān)注熱點(diǎn)。

其中親和力是抗體藥物是否具有藥效的關(guān)鍵功能屬性之一，Binding和Function是藥效初步評價(jià)中重要的兩環(huán)，對于候選藥物來(lái)說(shuō)，結合是其藥物發(fā)揮功能的必要條件。但在mAb的產(chǎn)生過(guò)程中，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾會(huì )產(chǎn)生差異導致各種糖型的產(chǎn)生。如果在治療劑的生產(chǎn)中使用不同的細胞系也可以看到糖基化變體，重要的是，糖基化的差異可對FcR結合產(chǎn)生深遠影響，從而對mAb治療效果產(chǎn)生深遠影響。因此評價(jià)一個(gè)候選藥物，其與靶點(diǎn)分子的結合能力是基礎也是重要的一方面。在研發(fā)過(guò)程中不論小分子藥物還是大分子藥物的研發(fā)過(guò)程中均會(huì )使用親和力(affinity)來(lái)評價(jià)候選分子和靶點(diǎn)分子之間結合的強弱。

本期內容：

  目前進(jìn)行抗體親和力檢測的方法有很多種，如平衡透析、硫氰酸鹽洗脫法、表面等離子共振技術(shù)（SPR）以及流式細胞術(shù)等。其中流式細胞法因為可以在體外使用表達特定抗原靶點(diǎn)的細胞來(lái)評價(jià)抗體與細胞膜表面靶點(diǎn)的親和力，模擬出更接近體內的抗體結合條件，因此越來(lái)越得到研究者的青睞。本文就以阿達木單抗（阿達木單抗是一種人腫瘤壞死因子TNF-α特異性重組IgG1單克隆抗體,對體內腫瘤壞死因子TNF-α 具有高度親和力）為例介紹如何通過(guò)流式細胞術(shù)來(lái)進(jìn)行阿達木單抗與細胞膜結合型TNF-α親和力評價(jià)的方法。

  實(shí)驗流程如下：

1. 準備穩定表達膜型TNF-α的工程化CHO-K1細胞，培養至80%融合后收集，離心后用PBS洗滌及重懸，后用含有1%馬血清的PBS調整濃度至4x10⁶個(gè)細胞/mL;

2. 取流式管然后分別標記為自發(fā)熒光（AF），TNF-α組，同型對照（ISO），缺少阿達木單抗組（WA）以及3-700 ng/mL 不同濃度的阿達木單抗組；其中AF組為不染色的CHO-K1細胞， TNF-α組為只有TNF-α APC抗體染色的細胞，ISO組為只加了阿達木單抗的細胞，WA組為只加了IgG PE抗體染色的細胞，阿達木組為分別加了不同濃度的阿達木抗體后進(jìn)行IgG PE染色的細胞；

3. 根據下表的要求進(jìn)行染色和上機操作

結果及分析：

  首先，通過(guò)設門(mén)策略圈出需要分析的單個(gè)CHO-K1細胞（Fig A and B），然后進(jìn)行相應通道的平均熒光強度（MFI）的比較。根據AF組與TNF-α組在APC通道上MFI的結果可以確定該CHO-K1細胞確實(shí)表達m TNF-α (Fig.1 C); 阿達木單抗組在PE通道的熒光強度增加表明IgG-PE可以與阿達木單抗進(jìn)行特異性結合，這些結果證實(shí)了該生物模型和流式細胞術(shù)檢測方法在體外評價(jià)阿達木單抗與靶細胞的結合是合適的。

Fig.1

  其次，分別計算3-700 ng/mL不同濃度的阿達木單抗組在PE通道的MFI (Fig.2 A), 然后通過(guò)不同濃度的MFI增加倍數以及阿達木單抗濃度(Log)用Graph Pad Prism軟件（在四個(gè)或五個(gè)參數的邏輯模型下測試）進(jìn)行曲線(xiàn)擬合（Fig.2 B）即可得到流式檢測阿達木單抗-mTNF-α復合物的結合量效曲線(xiàn)。

Fig.2

  流式細胞術(shù)不僅可用于與細胞表征和功能相關(guān)的檢測，也適合作為生物測定中的檢測方法。在生物測定中使用流式細胞儀的優(yōu)勢在于自動(dòng)化，靈敏度，染色控制和自我校準，可以獲得準確一致的測量結果。該生物測定的開(kāi)發(fā)和驗證的集體結果表明，它可以作為QC實(shí)驗室中常規方法，或作為阿達木單抗的表征和生物相容性的測試。并且該實(shí)驗條件可以標準化用于評估其他生物分子通過(guò)相同的機制行動(dòng)起作用并有助于擴展流式細胞儀在生物標記表征和生物仿制藥可比性證明中的應用。

  如需要進(jìn)一步了解實(shí)驗方案，請通過(guò)點(diǎn)擊左下角“閱讀原文"的信息與貝克曼庫爾特公司的技術(shù)支持聯(lián)系。

本文所列方法和數據參考以下文獻：

Camacho-Sandoval R, Sosa-Grande EN. Development and validation of a bioassay to evaluate binding of adalimumab to cell membrane-anchored TNFα using flow cytometry detection. J Pharm Biomed Anal. 2018 Jun 5;155:235-240. doi: 10.1016/j.jpba.2018.03.057.