擔心PCR擴增的影響？來(lái)看自動(dòng)化PCR-Free解決方案

常規高通量測序的文庫構建，需要PCR擴增。主要是為了對微量DNA樣本進(jìn)行擴增，提高庫容；另一方面，放大核酸熒光信號，提高測序準確度。然而，PCR擴增同樣也有著(zhù)無(wú)法忽視一些問(wèn)題：

1.      擴增過(guò)程中產(chǎn)生復制錯誤，累積下去，產(chǎn)生假陽(yáng)性；

2.      擴增會(huì )有一定的偏好性，比如GC含量異常的區域和二級結構等區域，擴增效率低，難以覆蓋；

3.      擴增的循環(huán)數越多，重復率（Duplication）越高，造成測序成本增加、浪費測序數據。

什么是PCR-Free技術(shù)

常規擴增建庫有諸多問(wèn)題，那么PCR-Free技術(shù)也就營(yíng)運而生。PCR-Free技術(shù)，相較于常規建庫，其建庫步驟為：基因組片段化-末端修復-加接頭-純化-文庫質(zhì)控，省去了PCR擴增的步驟。

1.      PCR-Free建庫技術(shù)：

2.      省去擴增步驟，縮短建庫時(shí)間；

3.      避免使用高保真聚合酶，降低建庫成本；

4.      減少擴增產(chǎn)生的復制錯誤；

5.      避免擴增偏好性；

6.      避免擴增產(chǎn)生的Duplication，降低測序成本。

llumina DNA PCR-Free Prep，Tagmentation DNA建庫即運用了PCR-free的建庫方式，并同時(shí)采用創(chuàng )新型鏈接在磁珠上的轉座酶（BLT），將接頭連接和DNA 片段化結合到一個(gè)簡(jiǎn)單快速的反應中，實(shí)現WGS高度均勻的覆蓋。

針對PCR-Free建庫方法，我們推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文庫構建自動(dòng)化方案，該方案可使用低投入量（25-99ng）或標準投入量（100-2000ng）gDNA進(jìn)行建庫，同時(shí)進(jìn)行96例樣本的建庫。

·        減少手動(dòng)操作時(shí)間

·        減少系統設置何潛在的移液錯誤

·        標準化工作流程改進(jìn)實(shí)驗結果

·        快速安裝

Biomek i7工作站

圖1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面

·        集成了96通道移液頭與靈活8通道移液頭；

·        靈活8通道可配置固定針和可替換吸頭通道搭配；

·        96通道可選擇上一列、一行、多行等不規則形狀排列吸頭，實(shí)現不定樣本數液體轉移；

·        斜側抓板機械手可360度旋轉，輕松實(shí)現臺面全覆蓋；

·        多達45個(gè)工作板位；

·        可實(shí)現震蕩、加熱/冷卻、吸頭清洗等功能；

·        開(kāi)放式工作桌面，可輕松整合外部設備，如（自動(dòng)PCR儀）。

圖2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自動(dòng)化工作流

使用Biomek i7工作站進(jìn)行 Illumina PCR free文庫構建，輕松解放雙手，把更多的活交給工作站來(lái)進(jìn)行

表1.  Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自動(dòng)化Illumina PCR free流程預估時(shí)間（大于100ng gDNA投入）

Method Options Selector (MOS）

MOS能夠選擇樣本數量、投入量、Index開(kāi)始使用位置，以最大限度地提高靈活性、適應性和方法執行的簡(jiǎn)易性。

圖3. Illumina PCR-Free建庫方法選項選擇器

Guided Labware Setup (GLS)

GLS基于MOS中選擇的選項生成的，并提供用戶(hù)特定的圖形設置說(shuō)明，包括試劑體積計算和準備試劑的分步說(shuō)明。

圖4. 引導式實(shí)驗室設置提供配方注釋?zhuān)甘驹噭┝浚ㄉ蠄D），

并指導用戶(hù)正確設置平臺（下圖）

DeckOptixFinal Check (DFC)

在開(kāi)始運行自動(dòng)化流程之前，BML中的DFC功能，會(huì )通過(guò)實(shí)時(shí)拍照的方式分析工作桌面耗材擺放，以減少設置錯誤，例如吸頭、深孔板擺放位置錯誤。

實(shí)驗設計

為了證明在i7雙雜交工作站上進(jìn)行96個(gè)樣品文庫制備的能力，我們從人細胞系NA12878 gDNA制備文庫。將起始濃度為150 ng、300 ng、400 ng、500 ng和750 ng的48個(gè)gDNA樣本以及陰性模板對照（NTC）隨機放入96孔板，如下所示。

實(shí)驗結果

·        隨機挑取了23個(gè) gDNA文庫進(jìn)行測序，平均插入片段為483bp±28bp

·        Reads mapping率為96.8%，標準偏差為0.1%

Biomek i7工作站上的Illumina  PCR free DNA文庫制備自動(dòng)化是一個(gè)獨立的解決方案，為任何規模的實(shí)驗室提供了高效、靈活和可擴展的解決方案。自動(dòng)化解決方案提供的文庫在下游工作流程中產(chǎn)生高質(zhì)量的結果，并節省了寶貴的時(shí)間和金錢(qián)。