速率區帶離心法 -你的分離純化方法選對了嗎？

密度梯度離心（isodensity centrifugation method）又稱(chēng)為區帶離心。

01

離心時(shí)先將樣品溶液置于一個(gè)由惰性梯度材料形成的密度梯度液體柱中

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離心后被分離組分以區帶層分布于梯度柱中

該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使樣品中幾種或全部組分分離，具有良好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純組分。

缺點(diǎn)是離心時(shí)間較長(cháng)，需制備梯度液，操作要求高。

按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為速率區帶離心法（rate zonal centrifugation method，R-Z）和等密度離心法 (isopycnic centrifugation method)。

速率區帶離心也可稱(chēng)為等區密度離心，是根據樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數將混合樣品進(jìn)行離心分離提純。

離心時(shí)將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料（如蔗糖、氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等）形成的梯度液柱上面，樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點(diǎn)的密度，否則無(wú)法得到理想的區帶離心效果。離心時(shí)，混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區帶，選擇適合的轉速和時(shí)間進(jìn)行離心，當各組分區帶距離拉得遠時(shí)，結束離心，然后將區帶取出。這樣只需通過(guò)一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純，其純度和回收率均可滿(mǎn)足要求。

優(yōu)點(diǎn)是一次分離純化，組分的沉降系數相差 20% 以上的即可選用此法，分辨力高，操作熟練可以將組分沉降系數相差 5%～10% 的樣品很好的分離。

缺點(diǎn)是材料的條件限制，樣品液濃度不能太高，否則操作條件很難控制，同時(shí)此法與差速離心法相比，處理樣品的量要小的多。

圖 1 速率區帶離心

速率區帶離心的時(shí)間必須嚴格控制，不能太短，否則樣品區帶不清，時(shí)間也不能太長(cháng)，否則待分離組分可能沉底。需要分離的樣品顆粒的沉降速度取決于顆粒形狀、大小、密度及離心力等因素。離心前后樣品的狀態(tài)如圖 1 所示。

速率區帶離心經(jīng)典的應用就是通過(guò)蔗糖密度梯度離心，進(jìn)行各種亞細胞器（核糖體、線(xiàn)粒體、Exosome 等）和病毒顆粒（病毒載體、疫苗等）的純化。例如，我們在上一期中得到的 70S 核糖體沉淀，經(jīng)過(guò)水解后，可利用蔗糖密度梯度離心，進(jìn)一步分離純化得到 50S 和 30S 的兩個(gè)亞基。具體的實(shí)驗流程如下：

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