Echo聲波移液合成生物學(xué)的DBTL角色

聲學(xué)微滴噴射（AED）技術(shù)使用聚焦的聲能實(shí)現高精度和準確度轉移納升級液滴。Echo這種非接觸式、無(wú)需吸頭、低體積加液技術(shù)將交叉污染的可能性降至一定程度，同時(shí)極大程度降低試劑和耗材的成本。迄今為止，Echo除了廣泛應用于高通量化合物篩選之外，還有另一個(gè)強大的技術(shù)應用方向——快速發(fā)展的合成生物學(xué)領(lǐng)域，如DNA合成和連接，Echo聲波移液使得PCR以及Golden Gate 和 Gibson兩種一步法DNA連接方法成功地縮小至納升級規模，極大地提高DNA合成和連接效率并有效將試劑成本降低20至100倍。大部分DNA組裝的費用成本是酶，包括DNA聚合酶，因此，將反應體積從微升縮小到納升級，同時(shí)保持高裝配效率，將使合成生物學(xué)家更容易完成DNA合成和組裝。這也使Echo聲波移液成為DNA生物鑄造廠(chǎng)時(shí)代的合成生物學(xué)中的一項工具性技術(shù)。比如在常規終點(diǎn)法PCR實(shí)驗中，Echo可將PCR反應體系降低至250nL，成功擴增出1.3kb的片段。

Gibson DNA連接方法是合成生物學(xué)中使用最多的技術(shù)，它可以組裝從DNA序列至小基因組重疊DNA片段大小，優(yōu)點(diǎn)是它與序列無(wú)關(guān)并生成無(wú)痕DNA連接產(chǎn)物。Golden Gate DNA連接方法利用TypeIIS限制性?xún)惹忻负瓦B接酶組合來(lái)組裝DNA片段。正如我們先前所介紹的一樣，使用Echo聲波移液，能夠實(shí)現這兩種一步式DNA連接反應的降本增效，可在250 nL、500nL和1000 nL反應體積下實(shí)現Gibson的正確組裝，效率可與手工實(shí)驗相媲美或優(yōu)于20 μL反應，這使試劑成本降低20倍以上；Golden Gate可實(shí)現50 nL 、250 nL和500 nL規模反應體積的DNA（手工實(shí)驗時(shí)通常為 15 μL反應）成功組裝，效率同樣高于手工實(shí)驗對照，使試劑用量至少降低30倍。

生物合成途徑的闡明和重構以及調控回路和網(wǎng)絡(luò )的工程設計，都需要蛋白質(zhì)功能的知識。植物一直被用作生物活性和高價(jià)值天然產(chǎn)物的來(lái)源，但由于植物之中大型基因家族的普遍存在，使得將特定功能與單個(gè)蛋白質(zhì)聯(lián)系起來(lái)具有挑戰性，同時(shí)也面臨需要付出大量努力來(lái)優(yōu)化表達和純化方案進(jìn)行蛋白質(zhì)表征這一技術(shù)瓶頸。Biofoundry的優(yōu)勢能夠加速“設計-構建-測試-學(xué)習"周期的能力，可加速優(yōu)化并實(shí)現酶活性的快速篩選；無(wú)細胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）結合了DNA模板、能量源、氨基酸、核苷酸三磷酸 （NTP） 和過(guò)量輔因子，以及含有翻譯機制的粗裂解物，是一種成熟的體外快速蛋白質(zhì)生產(chǎn)工具，顯著(zhù)優(yōu)勢是能夠直接進(jìn)行功能分析，而無(wú)需耗時(shí)的細胞破碎和純化方案，同時(shí)還適用于自動(dòng)化和小型化，減少操作錯誤和CFPS反應中的可變性，促進(jìn)主動(dòng)學(xué)習引導的反應條件優(yōu)化，并普遍增加實(shí)驗的通量，最大限度地減少DBTL循環(huán)中的“構建"時(shí)間。SynTrack是一個(gè)基于web的工作流程驅動(dòng)的bioCAM平臺，用于管理和跟蹤DNA制造過(guò)程。SynTrack導入boost的構建過(guò)程信息，其中包括操作人員（利用機器人平臺）執行所有“構建"操作的分步說(shuō)明。SynTrack可以為液體處理機器人（如Biomek FX和Echo平臺）生成移液指令，自動(dòng)將接收到的DNA片段重新排列到孔板中。通過(guò)Echo自動(dòng)化平臺構建2μL反應體積（手動(dòng)為20μL）進(jìn)行一步法Golden Gate DNA組裝反應，隨后構建2μL CFPS反應體系進(jìn)行蛋白表達，通過(guò)熒光素酶（該標簽可輕松去除）快速定量蛋白表達水平，隨后無(wú)需蛋白純化即可使用游離蛋白質(zhì)合成反應產(chǎn)物進(jìn)行多種功能表征。

使用Echo聲波移液配合無(wú)細胞蛋白合成（CFPS）技術(shù)也可在96和384孔板中進(jìn)行代謝工程檢測，通過(guò)Wood-Ljungdahl通路耦合的反向β氧化（r-BOX）通路，實(shí)現如C4-C6酸和醇生化產(chǎn)物的負碳合成，具有降低全球CO2排放的巨大應用潛能。正是由于模式生物大腸桿菌無(wú)細胞轉錄-翻譯（TXTL）在DNA定向體外蛋白質(zhì)合成的應用范圍越來(lái)越大，一些實(shí)驗室也開(kāi)發(fā)了全大腸桿菌TXTL工具箱，并通過(guò)Echo實(shí)現了流程自動(dòng)化。另一個(gè)無(wú)細胞合成生物應用方向是非模式生物體外原型設計和快速表征代謝途徑，加速體內生物合成途徑測試，使例如梭狀芽胞桿菌等非模式生物能夠利用可再生資源（木質(zhì)纖維素生物質(zhì)或CO和H2合成氣）生產(chǎn)更多高價(jià)值產(chǎn)品。使用DNA組裝設計自動(dòng)化軟件J5進(jìn)行結構設計和生成實(shí)驗運行worklist，發(fā)送至Echo自動(dòng)化平臺以2 μL體積進(jìn)行Golden Gate DNA組裝，可同時(shí)進(jìn)行多達6個(gè)部分（三個(gè)一定啟動(dòng)子和終止子序列的開(kāi)放閱讀框）的組裝，效率高達90%；這一質(zhì)粒系統將為非模式生物提供體外和體內生物合成途徑的簡(jiǎn)單測試框架，從而縮短開(kāi)發(fā)周期。非模式生物巨雙歧桿菌的天然無(wú)細胞（NCF）轉錄翻譯平臺的快速建立也借助了Echo，并和貝葉斯模型參數推斷方法相結合，可以在數小時(shí)內對基因表達工具進(jìn)行嚴格的表征，并且這個(gè)平臺還有望擴展到一系列其他重要的底盤(pán)微生物的合成生物學(xué)應用。

微生物系統中異源生產(chǎn)的特定高價(jià)值化學(xué)物質(zhì)大多需要資源密集型分析過(guò)程（如HPLC和MS）進(jìn)行定量，較低的分析通量使DBTL循環(huán)遇到了一定的瓶頸。而生物傳感器通常與基因表達系統耦合，為此人們越來(lái)越關(guān)注開(kāi)發(fā)熒光生物傳感器用于合成生物學(xué)中，來(lái)檢測小分子和物理信號。通過(guò)為Echo編寫(xiě)Python移液腳本，構建384或1536孔板的10μL或2μL熒光酶標檢測體系，基于大腸桿菌雙鍵還原酶（EcCurA）非特異性結合后熒光極大增強的特性，開(kāi)發(fā)了一種熒光復合物直接蛋白質(zhì)（DiPro）生物傳感器，作為微生物異源姜黃素酶促合成的檢測單元，且不需要任何額外的基因表達后步驟或特定的蛋白質(zhì)成熟要求。同樣，使用Echo進(jìn)行小反應體系的熒光素酶化學(xué)發(fā)光體系構建，高通量篩選分析脯氨酰寡肽酶異源表達變異株，將金屬響應開(kāi)關(guān)整合到蛋白質(zhì)中，也為精確調節蛋白質(zhì)功能提供了新的機會(huì )。

隨著(zhù)合成生物學(xué)的發(fā)展，使得通過(guò)大腸桿菌或釀酒酵母等微生物用于篩選氫化烯烴的酶，成為克服石油精煉過(guò)程中烯烴加氫面臨的催化劑中毒、傳質(zhì)限制、發(fā)熱以及與氫氣、儲存和催化劑等相關(guān)的一個(gè)重要的解決方案。相比于LC/GC-MS復雜的工作流程和較長(cháng)的分析時(shí)間，使用Echo聲波移液和薄層色譜搭建的自動(dòng)化96孔篩選平臺極大地提高了檢測速度，使并行多個(gè)樣品檢測即時(shí)可視化，讀值結果更可靠，成為一種高效的篩選流程，用于確定與工程化GGR蛋白文庫相關(guān)的酶活性和產(chǎn)物形成譜。使用Echo將環(huán)氧化反應產(chǎn)物“打印"涂覆在薄層二氧化硅上，根據環(huán)氧化程度進(jìn)行色譜分離，并與發(fā)色團共價(jià)連接，從而可以檢測具有一定產(chǎn)物分布或增強還原酶活性的酶變體。經(jīng)過(guò)GC-MS驗證，這種基于薄層色譜的篩選可以區分選定突變體酶活性的四倍差異。

Echo高通量DNA組裝還被用于在釀酒酵母固氮基因組合文庫中篩選功能性固氮酶異源表達基因，為固氮谷物開(kāi)發(fā)并改變全球農業(yè)系統提供極大支撐。DNA組裝和Echo自動(dòng)化液體處理結合技術(shù)也入選了高校合成基因組暑期課程，這一培訓課程旨在向研究人員傳授合成生物學(xué)和合成基因組科學(xué)最新進(jìn)展背后的理論和實(shí)踐技能，通過(guò)軟件研討會(huì )、課程和該領(lǐng)域成員的研究講座，與會(huì )者能夠在了解相關(guān)原理和技術(shù)的同時(shí)，在基于實(shí)驗室的實(shí)踐課程中直接使用合成生物學(xué)平臺開(kāi)發(fā)的軟件和載體進(jìn)行驗證。在課程具體實(shí)踐中，Echo自動(dòng)化DNA組裝技術(shù)大大提高了用于設計β-胡蘿卜素異源通路文庫的表達檢測的通量。同時(shí)，使用該平臺進(jìn)行的番茄紅素代謝途徑的自動(dòng)化設計和構建成果也于2020年發(fā)表。

通過(guò)以上案例我們可以發(fā)現，Echo聲波移液在DBTL循環(huán)中起到承上啟下的串聯(lián)角色，既可接受“設計"流程中基于集成運算生成的腳本指令完成DNA組裝，撐起“構建"階段一眾重要的應用方向；又可在“測試"過(guò)程中實(shí)現高通量自動(dòng)化以及小體系精準檢測，并傳遞數據為“學(xué)習"階段提供支撐，因而是合成生物學(xué)和Biofoundry的好幫手。

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