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【流式應用知多少】21色實(shí)驗？其實(shí)也不難
Dr. Ravi Mylvaganam采用20個(gè)熒光抗體以及一個(gè)細胞死活染料組成21色的panel，可同時(shí)檢測多群記憶、效應T細胞，調節性T細胞，NK細胞甚至是干細胞樣T細胞等細胞亞群，詳細的抗體和染料標記如下所示：
實(shí)驗樣本準備步驟：
1. 標記一個(gè)樣本管，在管中添加3 µL以下抗體：
- 1) CD3 BUV395
- 2) CD19 BUV496
- 3) CD56 BUV737
- 4) CD25 BV605
- 5) CD95 BV650
- 6) CD38 BV786
- 7) CD16 PerCP
- 8) CD4 PerCP-eFluor710
- 9) CCR4 PE-TexasRed
- 10) CCR7 PC7
- 11) CD8 AF790
2. 添加25 µL Brilliant Stain Buffer，渦旋混勻4秒；然后加入100 µL全血，再次渦旋混勻4秒后，在37ºC下避光孵育20分鐘
3. 在試管中添加5 µL以下抗體：
- 1) CD57 Pacific Blue
- 2) CD45 Krome Orange
- 3) CD45 RA FITC
- 4) CCR6 PE
- 5) CD14 PC5
- 6) PD-1 (CD279) PC5.5
- 7) CD27 APC
- 8) CD127 APC-A700
- 9) CD28 APC-A750
4. 渦旋混合試管4秒后室溫避光孵育20分鐘
5. 在管中添加1 mL VersaLyse裂解液，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育15分鐘
6 樣本200g離心5分鐘，棄去上清液
7. 在試管中添加5 µL IR Fixable染料，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育20分鐘
8. 添加2 mL PBS重懸細胞，200g離心處理試管5分鐘，棄去上清液
9. 添加0.9 ml PBS和0.1 ml IOTest3固定液重懸細胞，可準備上機檢測
10. 同時(shí)按照上述的孵育、離心操作制備單染管
實(shí)驗結果如下
從實(shí)驗結果圖可以看出，這個(gè)21色方案的結果分群清晰，不論是常規的CD3+CD4+Th細胞還是含量較低的Treg或者干細胞樣T細胞，都能很好的檢測到，看來(lái)對于CytoFLEX LX而言，21色實(shí)驗也不是一個(gè)難題。如果您需要該方案詳細的信息，可與我們聯(lián)系。
多色補償問(wèn)題的簡(jiǎn)化，與流式細胞儀技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。遙想小編當年，那個(gè)流式細胞儀用完后還要用紅布蓋起來(lái)的年代，我剛開(kāi)始接觸的是一臺4色的流式，當時(shí)4色實(shí)驗就是“多色”實(shí)驗了！那時(shí)沒(méi)有離線(xiàn)補償也沒(méi)有自動(dòng)補償，流式也沒(méi)做得那么頻繁，調補償是相當刺激的操作：先在17寸顯示屏上畫(huà)滿(mǎn)所有通道兩兩對應的散點(diǎn)圖，上樣之后一定要眼疾手快反應迅速默念“橫平豎直”，如果相關(guān)的門(mén)沒(méi)圈好，或者看到補償矩陣nao zi蒙圈不知道調哪里，一著(zhù)急就手足無(wú)措，經(jīng)常一管單染管跑完補償還沒(méi)調好所以實(shí)驗前師兄師姐往往要提醒“單染管多準備點(diǎn)樣本”……
現在儀器的補償操作相比以前，我的天，簡(jiǎn)直不要好太多！
拿這個(gè)做21色方案的CytoFLEX LX舉個(gè)栗子：
首先，它可以自動(dòng)調補償，用戶(hù)只需要把單染管全跑一遍，圈好相應的陰陽(yáng)性細胞群，點(diǎn)擊計算補償就OK了，無(wú)論是2色還是21色都是這么簡(jiǎn)單的操作。畫(huà)一堆圖看橫平豎直？不存在！
其次，它可以離線(xiàn)調補償。樣本比較多，想測完再拷回去慢慢分析？沒(méi)問(wèn)題！
然后，CytoFLEX LX有補償庫功能，只要是做過(guò)的染料就可以把這個(gè)染料的補償信息存到庫里，以后做實(shí)驗可以直接讀取，避免需要重復做單染管的煩惱。 后，這個(gè)是的技能，方案里調好的補償會(huì )根據后續電壓的調整而自動(dòng)調整。也就是說(shuō)，以后做完補償，跑樣本時(shí)發(fā)現某個(gè)通道的電壓如果再調一點(diǎn)就了，如果是以前或其他儀器，您需要調整電壓后再重新調補償，而現在在CytoFLEX LX 上，您直接調電壓就好了！
其實(shí)很簡(jiǎn)單， 其實(shí)很自然，多色的補償并沒(méi)有那么難！雖然補償的操作更智能化了，但目前多色實(shí)驗中抗體和染料的選擇以及樣本的處理仍然是一門(mén)學(xué)問(wèn)。如果您需要了解多色實(shí)驗更多的信息，比如染料的搭配和選擇，以及樣本處理的方法，您也可以聯(lián)系貝克曼公司索取資料。
* CytoFLEX LX流式細胞儀僅用于科研，不用于臨床診斷。
