—— PROUCTS LIST
高通量篩選大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)用酵母營(yíng)養素
隨著(zhù)重組DNA技術(shù)的迅猛發(fā)展,外源基因在不同宿主中的表達使得各種重組蛋白的工業(yè)生物生產(chǎn)成為可能。選擇合適的宿主是生物工藝設計中的關(guān)鍵步驟之一,具體取決于:
1.上游培養效率
2.易于基因編輯和分子工具的可用性
3.翻譯后修飾的能力,如糖基化
4.蛋白質(zhì)(用于下游加工和作為生物制藥成分等)的分泌能力
目前,多種生物已被應用于重組蛋白的生產(chǎn),尤其是大腸桿菌,易于基因改造,具有在酵母水解物等多種基質(zhì)上快速生長(cháng)并產(chǎn)生高蛋白滴度的優(yōu)勢。已成為迄今為止業(yè)界追捧的主力軍。
典型的生物工藝優(yōu)化通常需要進(jìn)行一些初步試驗,以發(fā)現適用于宿主菌株并提高目的重組蛋白表達的培養基成分(特別是氮基營(yíng)養素)。對于此類(lèi)應用需求,能夠提高實(shí)驗效率和參數準確度的高通量篩選平臺成為熱門(mén)工具。貝克曼庫爾特BioLector通過(guò)在線(xiàn)測量關(guān)鍵培養參數提供可放大的高通量分析。
本案例為通過(guò)BioLector對多種酵母營(yíng)養素就生物量生長(cháng)和重組蛋白的形成進(jìn)行評估和比較,篩選出了適合大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)和誘導時(shí)間的理想培養基。
方法
培養菌株:大腸桿菌BL21(DE3)pET-28a(+)EcFbFP。
培養基:以標準TB培養基(Carl Roth)為參照物,對多個(gè)TB 樣(Terrific 液)培養基進(jìn)行比較。不同的TB 樣培養基使用不同的酵母提取物。
BioLector培養條件:在接種至微孔板之前,先在250 mL搖瓶中進(jìn)行預培養, 37°C培養6小時(shí)。然后使用48孔梅花板(MTP-BOH2)在 BioLector中進(jìn)行培養。溫度 37°C ,振搖速度:1400 rpm。分別在每個(gè)培養孔中填充800μL培養液用于非誘導實(shí)驗,填充790μL用于誘導實(shí)驗。誘導實(shí)驗中,在誘導時(shí)間點(diǎn)上添加 10μL 50μM 的 IPTG。環(huán)境氧氣濃度保持在35%,避免培養物缺氧。
BioLector在線(xiàn)測量:培養過(guò)程中對生物量、EcFbFP(黃素熒光蛋白)、pH以及 DO進(jìn)行在線(xiàn)測量。
結果
不同TB樣培養基的生物量生長(cháng)情況:
培養實(shí)驗中,不同酵母營(yíng)養素的培養基中生物量的生長(cháng)情況如上圖所示:培養基不同,最終的光密度和生長(cháng)速率也會(huì )不同。ProCel 6 中的大腸桿菌OD最高,培養基 ProCel 3 中的大腸桿菌的OD低。ProCel 6為本特定工藝的最高生長(cháng)速率。
上圖為培養過(guò)程的DO值。培養基 ProCel 3 和 ProCel 4 中的培養物未達到0%的氧飽和度,這表明由于耗氧量有限,該培養基中的菌株代謝活性較低。相反,其他培養物包括TB標準培養基,均在短時(shí)間內達到0%的氧飽和度,表明菌株代謝活性高。
不同酵母營(yíng)養素TB樣培養基的產(chǎn)物生成:
通過(guò)將IPTG 添加到培養物中來(lái)誘導 T7 聚合酶的表達促進(jìn)黃素熒光蛋白的生成。BioLector使用梅花板為48個(gè)培養物提供了獨立的培養空間,因此可測試不同的誘導時(shí)間點(diǎn)。使用自動(dòng)化工作站整合BioLector后的 RoboLector 系統還可以自動(dòng)進(jìn)行培養誘導。
首先選擇一個(gè)固定的誘導時(shí)間點(diǎn)。分別為培養啟動(dòng)后的3小時(shí)、3.75小時(shí)和4.5小時(shí)。下圖所示為每種TB樣培養基在誘導時(shí)間下所測熒光的平均值。熒光動(dòng)力學(xué)清晰地表明不同培養基有不同的EcFbFP(黃素熒光蛋白)表達水平。
表現出*熒光信號的兩個(gè)樣本為:ProCel 2,誘導點(diǎn)為3.75小時(shí);ProCel 5,誘導點(diǎn)為 3 小時(shí)。經(jīng)過(guò) 7.7 小時(shí)的培養,ProCel 5 的熒光值達到102.94a.u.,而ProCel 2 的熒光值達到 101.82 a.u.。本方法的不足之處在于未比較不同樣本的生物量對蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響。經(jīng)過(guò)3小時(shí)的培養,一些培養物的OD已達到6,而其他培養物僅達到3。當誘導具有不同光密度的培養物時(shí),可能會(huì )對在每種酵母營(yíng)養素上生長(cháng)的實(shí)驗大腸桿菌的蛋白質(zhì)生產(chǎn)性能造成誤解。
鑒于此,我們采用了一種新方法,將誘導點(diǎn)與生物量信號耦合。使用BioLector的信號驅動(dòng)RoboLector,依賴(lài)于特定生物量的誘導對于每個(gè)單獨的孔都是可行的。為自動(dòng)化工作站設置3、6或8的OD目標值,以根據孔內培養物的生長(cháng)動(dòng)力學(xué)自動(dòng)添加IPTG以誘導蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
如下圖所示,ProCel 2表現最佳,最終值為 146.23 a.u.,培養時(shí)間是 12.3 小時(shí);ProCel 5表現次之,最終值為138.1 a.u.。與之前進(jìn)行的一系列實(shí)驗相比,本實(shí)驗中的排名與在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行誘導的實(shí)驗不同。這一觀(guān)察證明了最佳工藝條件的重要性,并使這些條件具有可比性。此處數據表明:與之前的實(shí)驗相比,本實(shí)驗中的熒光值更高。正如該領(lǐng)域諸多論文中所強調的那樣,誘導時(shí)間確實(shí)是一個(gè)關(guān)鍵參數。同樣,在優(yōu)化大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)的過(guò)程中,也必須評估誘導劑的濃度。另外,與對照TB培養基相比,這里測試的一些酵母氮源產(chǎn)生了更高的重組蛋白產(chǎn)量。這些結果凸顯了選擇培養基成分的重要性,這些成分能夠在特定的生物工藝中實(shí)現高而穩定的產(chǎn)量。
結論
通過(guò)BioLector系統,貝克曼庫爾特可為用戶(hù)提供適用于各種應用領(lǐng)域的高通量篩選平臺。其*的梅花形微孔板尤其適用于好氧培養,如同實(shí)驗室生物反應器,BioLector系統通過(guò)非侵入式傳感器使客戶(hù)能夠獲取更多的在線(xiàn)測量參數。正如本應用,通過(guò)BioLector系統可輕松實(shí)現培養基的篩選,整合自動(dòng)化工作站的RoboLector,還可實(shí)現更多功能。補料、pH調控以及文中所述的誘導功能,所有這些均可在小規模實(shí)驗中實(shí)現,幫助客戶(hù)同時(shí)兼顧成本和效率。
RoboLector高通量自動(dòng)化微型生物培養平臺
欲了解該應用詳情,請掃描下方二維碼下載應用指南《利用BioLector進(jìn)行大腸桿菌重組蛋白生產(chǎn)用酵母營(yíng)養素的篩選》