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貝克曼庫爾特 | 生物反應器可以進(jìn)行細胞裂解、應激及毒性篩選的測定嗎
微生物反應器的主要功能是模擬微生物生長(cháng)或生產(chǎn)的自然環(huán)境，通過(guò)生化反應或微生物自身的代謝獲得目標產(chǎn)物。
那么，它可以被用來(lái)進(jìn)行細胞裂解、細胞應激及細胞毒性篩選的測定嗎？由于這類(lèi)實(shí)驗通常樣品量比較大，或者需要離線(xiàn)檢測，又或者需要為此重新配置設備，同時(shí)人力和實(shí)驗成本也相當高等等。也許你會(huì )覺(jué)得不太可能。
但是，貝克曼庫爾特的新技術(shù)BioLector XT高通量微型生物反應器卻可以做到。
BioLector XT高通量微型生物反應器
BioLector進(jìn)行細胞裂解、應激及毒性篩選的測定：
PI是一種多功能染料，常用于鑒別細胞群中的死細胞，并在多色熒光技術(shù)中用作復染劑。它僅能穿透細胞膜破裂的死細胞，嵌入細胞脫氧核糖核酸（DNA）后釋放紅色熒光，而不能穿透細胞膜完整的活細胞。
BioLector結合 PI 染色法進(jìn)行細胞裂解、細胞應激及毒性篩選的具體應用。
方法
大腸桿菌培養：采用 BioLector進(jìn)行大腸桿菌 Bl21（DE3）菌種培養，培養條件：溫度 37° C，振搖速度 800 rpm），微孔板為 BOH2 型 FlowerPlate® 微孔板（MTP），每孔填樣體積為800µL。培養基為緩沖液濃度為 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS。
PI 濃度：將 1mM PI 染色液溶于磷酸鹽緩沖液中配制 PI 原液。此原液需無(wú)菌過(guò)濾并在 4° C 下儲存。PI 嵌入 DNA 時(shí)，為避免對用戶(hù)造成傷害，培養基中的最終 PI 濃度不應過(guò)高。在本應用指南中，培養基最終 PI 濃度應為 5 µM。
誘導細胞死亡：在此培養案例中，通過(guò)在 7 小時(shí)后將培溫度提升至 50°C或加入純甲醇（MeOH）來(lái)誘導細胞死亡。
測定死亡細胞：誘導細胞死亡后，PI 滲入細胞膜破裂的細胞與 DNA 結合，導致熒光偏移，然后通過(guò)PI 濾光片模塊檢測死亡細胞的熒光信號。
結果
細胞毒性篩選：采用 BioLector 進(jìn)行PI 染色和檢測進(jìn)行細胞毒性篩選。添加 MeOH 對大腸桿菌 BL21（DE3）進(jìn)行應激培養，如下圖所示。
不同濃度的MeOH作為應急因素對大腸桿菌培養的細胞毒性篩選
培養 7 小時(shí)后，添加 27%v/v MeOH 時(shí)生長(cháng)停滯，可通過(guò)散射光信號和 DO 信號檢測得出：添加 MeOH 后 DO 信號立即增至初始值（100 %），表明細胞開(kāi)始凋亡。添加 9%v/v MeOH 導致散射光信號減弱，表明生長(cháng)斜率下降與 DO 信號相呼應。18 小時(shí)后，添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的細胞最終 PI 信號分別為 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.。該結果對5µM PI培養基進(jìn)行了空白扣除。
細胞裂解的測定：如圖所示，培養 7 小時(shí)后，將溫度從 37° C 提升至 50°C 以誘導細胞裂解。散射光信號表明，經(jīng) 5 µM PI 處理的大腸桿菌未進(jìn)一步生長(cháng)，熱處理 1 小時(shí)后對照組也未進(jìn)一步生長(cháng)。未經(jīng)熱處理大腸桿菌（+ 5µM PI）的生長(cháng)曲線(xiàn)顯示，細菌在 11 小時(shí)前呈指數增長(cháng)，之后進(jìn)入穩定期。熱處理后大腸桿菌停止生長(cháng)，2 小時(shí)后，細胞開(kāi)始裂解，因此 PI 信號呈線(xiàn)性增強，并約在培養 14 小時(shí)后達到飽和。之所以延遲 2 小時(shí)，是因為熱量在液體中分布并作用于細胞需要時(shí)間。未經(jīng)熱處理組的 PI 曲線(xiàn)在指數生長(cháng)期可觀(guān)察到背景熒光信號。
采用BioLector 通過(guò) PI 染色測定細胞裂解
應激細胞測定：在正在進(jìn)行的培養實(shí)驗中，散射光和 PI 信號的結合有助于識別應激細胞。在以下案例中，大腸桿菌BL21 分別在兩種不同 MOPS 緩沖液濃度的 Wilms-MOPS 培養基中培養。下圖表示散射光、DO 信號、pH 值和 PI 信號隨培養時(shí)間變化的實(shí)驗結果。更多解析請見(jiàn)應用指南《利用BioLector進(jìn)行細胞死亡的測定》。
采用 BioLector通過(guò) PI 測量應激細胞
從上述應用可以看到貝克曼庫爾特 BioLector高通量微生物反應器，不僅可以進(jìn)行48個(gè)樣品的高通量發(fā)酵，同時(shí)在線(xiàn)參數檢測、補料和PH調控，從而實(shí)現高通量菌種篩選和工藝優(yōu)化，而且結合 PI 染色法可以進(jìn)行細胞裂解、細胞應激及毒性篩選的測定。
